Контакты
Главная / Упражнения

Методы выделения и очистки белков. Основные методы разделения и очистки белков Разделение белков

Состав и количество фракций белков в биологических жидкостях зависит от применяемого метода фракционирования:

1. Осаждение

  • нейтральными солями (высаливание) - способность белков плазмы выпадать в осадок при воздействии на них растворов солей различных концентраций,
  • этиловым спиртом при низкой температуре;

2. Электрофоретическое фракционирование - различают несколько типов электрофореза в зависимости от поддерживающей среды. В качестве поддерживающих сред используют бумагу, ацетатцеллюлозную пленку, агаровый, полиакриламидный, крахмальный гели. При проведении электрофореза необходимо учитывать факторы, влияющие на подвижность разделяемых веществ:

  • заряд (обычно зависит от pH), размеры и форма молекул веществ;
  • электрическое поле : скорость миграции ионов прямо пропорциональна силе тока, обусловленной переносом ионов буфера и образца, напряжению и обратно пропорциональна сопротивлению (зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера);
  • тип буфера : состав, концентрация, pH, ионная сила. Ионная сила равна сумме n составляющих: с n z n 2 / 2, где с n - молярная концентрация n-ого иона, z - заряд этого иона;
  • носитель : учитывается его гидрофильность, адсорбция веществ на молекулах носителя, электроосмос, диффузия.

3. Иммунологические методы - основаны на иммунных свойствах белковых фракций: иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, радиальная иммунодиффузия, радиоиммунный анализ;

4. Седиментационный анализ - основан на различной зависимости скорости оседания белков от массы и величины их молекулы;

5. Ионообменная, адсорбционная, распределительная, аффинная хроматография , гель-фильтрация .

Наиболее распространенным методом фракционирования является электрофорез , основанный на разной скорости движения белков в электрическом поле, в зависимости от величины заряда и молекулярной массы. Количество выделяемых фракций определяется условиями проведения электрофореза и качеством поддерживающей среды. Так, например, при электрофорезе на бумаге и пленках ацетата целлюлозы выделяют 5 фракций (альбумины, α 1 –, α 2 –, β– и γ–глобулины), в то время как в полиакриламидном геле - до 20 и более фракций. При использовании более совершенных методов (радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и других) в составе глобулиновых фракций выявляются многочисленные индивидуальные белки.

За основу классификации белков по фракциям принято разделение белков на бумаге. На протеинограмму оказывают влияние только те белки, концентрация которых достаточно высока.

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространены методы электрофореза на бумаге и на ацетатцеллюлозных пленках. В качестве унифицированного утвержден метод электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках.

Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом

Принцип

Фосфатные буферы разной молярной силы осаждают соответствующие фракции белка, при этом более концентрированные буферы осаждают более мелкодисперсные фракции белка. По степени мутности судят о концентрации фракций белка.

Метод электрофоретического разделения белков на бумаге и ацетатцеллюлозных пленках

Принцип

Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока: в щелочной среде к аноду, в кислой - к катоду. В щелочной среде наиболее быстро перемещаются альбумины, α 1 -, α 2 - и β-глобулины.

Более подробное описание метода электрофореза можно прочитать .

Нормальные величины

Сыворотка крови
преальбумин 0,6-1,4% 0,18-0,38 г/л
альбумин 50-70% 30-50 г/л
α 1 -глобулины 3-6% 1-3 г/л
α 2 -глобулины 9-15% 6-10 г/л
β-глобулины 8-18% 7-11 г/л
γ-глобулины 15-25% 8-16 г/л
Cоотношение альбумин / глобулины 1,5-2,3
Спинно-мозговая жидкость
преальбумин 2-7%
альбумин 56-76%
α 1 -глобулины 2-7%
α 2 -глобулины 4-12%
β-глобулины 8-18%
γ-глобулины 3-12%
Моча
альбумин 20%
α 1 -глобулины 12%
α 2 -глобулины 17%
β-глобулины 43%
γ-глобулины 8%

Клинико-диагностическое значение

Диагностическое значение измерения преальбуминв и альбумина рассмотрено

Сыворотка

Глобулины

На практике диагностически значимо только повышение уровня белковых фракций.

Повышение α 1 - и α 2 -глобулиновой фракции связано с острыми и подострыми воспалительными процессами и некоторыми злокачественными опухолями, травмами, т.к. сюда входит большинство белков острой фазы (С-реактивный белок, α 2 -макроглобулин, α 1 -гликопротеид, α 1 -антитрипсин, церулоплазмин, гаптоглобин).

Большая часть белков β-глобулиновой фракции является β‑липопротеинами, поэтому повышение этой фракции чаще всего связано с гиперлипопротеинемиями. Кроме того, влияние на динамику этой фракции оказывают трансферрин, гемопексин, компоненты системы комплемента.

Фракция γ‑глобулинов увеличивается при патологических состояниях, связанных с хроническими воспалительными процессами, т.к. содержит иммуноглобулины G, A и M.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

2. Высаливание

4. Электрофорез белков

5. Ионообменная хроматография

6. Ультрацентрифугирование

1. Методы разделения белков и пептидов

Для разделения белков и пептидов применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы гидратных оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок. На этих принципах основывается метод высаливания.

2. Высаливание

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щелочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания. Этот метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

Наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматографические методы, основанны на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

белок пептид молекулярный

3. Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами.

Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В его структуре образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают, пропуская через колонку растворитель. Вместе с растворителем движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.

4. Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительно заряженные белки - к катоду.

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, б1 глобулины, б2-глобулины, в-глобулины и г-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

5. Ионообменная хроматография

Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков.

6. Ультрацентрифугирование

Метод разделения основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость оседания веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге пропорционально их молекулярной массе.

На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой. После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

7. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Список использованной литературы

1. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. (http://www.biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Content.html)

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

    Общие принципы препаративной химии белков, особенности их выделения. Удаление небелковых примесей, разделение между собой собственно белковых компонентов. Характерные свойства белков, на которых основано разделение, гель-хроматография (гель-фильтрация).

    научная работа , добавлен 17.12.2009

    Аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков. Моноаминодикарбоновые кислоты и их амиды. Энантиомерия аминокислот, образование солей. Мезомерия и строение пептидной связи. Методы выделения и анализа белков. Электрофорез в полиакриламидном геле.

    презентация , добавлен 16.12.2013

    Роль в живой природе. Состав и свойства белков. Классификация белков. Определение строения белков. Определение наличия белка. Идентификация белков и полипептидов. Синтез пептидов. Искусственное получение белка. Аминокислоты.

    реферат , добавлен 01.12.2006

    Хроматографическая система - метод разделения и анализа смесей веществ. Механизм разделения веществ по двум признакам. Сорбционные и гельфильтрационные (гельпроникающие) методы. Адсорбционная, распределительная, осадочная и ситовая хроматография.

    реферат , добавлен 24.01.2009

    Хроматографический метод разделения и анализа сложных смесей был открыт русским ботаником М.С. Цветом. Хроматография - многократное повторение актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.

    курсовая работа , добавлен 13.03.2011

    Классификация биополимеров. Аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков, строение и свойства. Моноаминодикарбоновые кислоты и их амиды. Образование солей. Пептидная связь. Уровни структурной организации белка. Нуклеиновые кислоты и их производные.

    презентация , добавлен 28.02.2012

    Белки как высокомолекулярные природные соединения, состоящие из остатков аминокислот, которые соединены пептидной связью. Качественный состав белков, их структура и функции. Процессы гидролиза (кислотно-основного, ферментативного) и денатурация белков.

    презентация , добавлен 11.02.2015

    Место гель-фильтрации среди методов колоночной хроматографии. Основные материалы гранул ("матриц") для нее. Гели на основе целлюлозы. Использование детекторов вещества и коллектора фракций. Аппаратура для жидкостной хроматографии высокого давления.

    реферат , добавлен 11.12.2009

    Белки как полимеры с пептидной связью. Образование макрокомплекса (олигопротеина), состоящий из нескольких полноценных белковых субъединиц. Фибриллярные и глобулярные группы. Анализ и синтез белков. Метод Меррифилда - твердофазный синтез пептидов.

    реферат , добавлен 21.02.2009

    Общая характеристика, классификация, строение и синтез белков. Гидролиз белков с разбавленными кислотами, цветные реакции на белки. Значение белков в приготовлении пищи и пищевых продуктов. Потребность и усвояемость организма человека в белке.

    высаливание : осаждение солями щелочных, щелочноземельных металлов (хлорид натрия, сульфат магния), сульфатом аммония; при этом не нарушается первичная структура белка;

    осаждение : использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах (около –20 С).

При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.

Денатурация - нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).

Методы разделения белков Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Диализ

Используют специальную полимерную мембрану, которая имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия) (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Разделение белков методом ультрацентрифугирования

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют бóльшие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, бóльшие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие (рис. 2.3).

Рис. 2.3 . Разделение белков методом электрофореза в геле

Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na) .

Выделение индивидуальных белков

Аффинная хроматография

Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку, и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Изоэлектрофокусирование

Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, у которого заранее сформирован градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).

Двухмерный электрофорез

Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце (рис 2.4).

    Выделение белков из биологического материала.

    Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.

    Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших работ.

    Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения оставшихся пор.

Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся разделенные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают антитела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным антителам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молекулярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки используются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: стандартизация метода и улучшение результатов.

    Обработка раствором первичных антител  связывание происходит в том месте пластины, где есть антиген (искомый белок).

    Удаление несвязавшихся антител (промывка).

    Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки.

    Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка).

Рис. 2.4 . Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке появляется полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антителами.

На каких физико-химических особенностях белков могут быть основаны способы их разделения? Во-первых, это размер молекулы, ее геометрия. На использовании этой особенности базируются методы гель-хроматографии и ультрафильтрации, отчасти электрофорез в гелях.

Во-вторых, характерное для данного белка распределение заряженных групп на его поверхности. Соотношение катионных и анионных групп в белке меняется в зависимости от рН, изоэлектрические точки белков -- pI (значения рН, при котором положительные и отрицательные заряды белка полностью компенсированы и суммарный заряд равен нулю) существенно различаются у разных белков. Известны белки, являющиеся в физиологических условиях катионными, анионными или молекулами без заметного преобладания того или иного заряда. На различии заряда белков при разных рН основано их разделение методами электрофореза, изоэлектрического фокусирования, изоэлектрической и ионообменной хроматографии. Существенно, однако, не только соотношение заряженных групп, определяющее значение pI. Белки со сходными изоэлектрическими точками могут различаться распределением заряженных функциональных групп по поверхности глобулы. Последние размещаются более или менее равномерно либо; наоборот, образуют локальные сгущения, гроздья одинаково заряженных групп, что сказывается при ионнообменной хроматографии белка.

В-третьих, белки различаются числом и характером гидрофобных участков поверхности, что используют при гидрофобной хроматографии

Заметим, что ни один из рассмотренных выше признаков не может сам по себе обеспечить выделение индивидуального белка из сложной смеси -- они недостаточно характеристичны, не гарантируют избирательности очистки. Значительно более перспективно в этом отношении

использование для выделения функциональных свойств белка. Действительно, среди множества белков в исходном материале найдется немало таких, которые имеют сходную молекулярную массу или близкие изоэлектрические точки, однако число, например, фосфатаз или амилаз будет заведомо небольшим. Очевидно, что метод выделения, основанный на использовании способности этих ферментов взаимодействовать со своим специфическим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующийся на разнице физико-химических свойств.

Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо принцип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и дополняют друг друга.

Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация)

В этом методе используют гранулированные гели поперечно-сшитых гидрофильных материалов, например декстрана (сефадекс, сефароза и их аналоги), полиакриламида (биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл). Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема для крупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера и хорошо проницаема для небольших молекул, солей и воды. В зависимости от среднего размера ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступна большая или меньшая часть общего объема гранул геля.

При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колонке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проникшие в гель, задерживаются в нем. Таким образом, они отстают от более крупных молекул, которые не могут войти внутрь гранул и находятся только в омывающем их растворе. Не будучи включенными в гель, крупные молекулы появляются в элюате, как только через колонку пройдет "свободный" объем раствора, равный объему раствора, заключенному между гранулами геля. Последний определяется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в виде которых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободный объем составляет 30--35% общего объема колонки.

Если размеры молекул белка таковы, что они могут проникать в поры, составляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элюции и белок появится в объеме V e , связанном с коэффициентом доступности (долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением:

где V, -- полный объем колонки, за вычетом той его части, которая приходится на сам гель образующий полимер.

Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы соответствует свое значение, на чем и основало разделение при гель-хроматографии. Понятно, что если объем элюции близок к свободному объему, то стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (V e близок к и стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наилучшее разрешение получается, если находится в пределах 0,4 -- 0,6. Разумеется, пределы разделения можно расширить, используя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших -- мелкопористые гели.

Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков определяется не молекулярной массой, а геометрическими размерами молекулы. Соответственно, молекулы вытянутой формы за счет "кувыркания" в растворе труднее проникают в гели, чем сферические молекулы такой же молекулярной массы. Этим объясняется ранняя элюция денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядоченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула.

Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белка (справедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкость эксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определения молекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствующим гелем, калибруют набором белков с известными молекулярными массами, после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молекулярную массу интерполяцией. Точность метода не очень велика, но вполне достаточна для большинства практически встречающихся задач.


При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гель, образующий материал не вполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаимодействовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость матрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белком мало отражается на процессе.

Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ионообменными взаимодействиями, в частности содержанием отрицательно заряженных групп в полисахаридных матрицах (сефароза, сефадекс), а также в полиакриламидных материалах. В последних карбоксильные группы возникают при спонтанном гидролизе амидов, в полисахаридах же они могут образовываться в результате окисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообменными взаимодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, например лизоцима и некоторых субтилизинов. Нередко она весьма значительна и может даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах такое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы раствора.

Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель-хроматографии, особенно заметная при выделении небольших молекул, например пептидов. -- гидрофобное связывание с матрицей геля.

Гидрофобные элементы включаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшивающими агентами, в частности эпи-хлоргидрином, при синтезе сефадекса. Пептиды, содержащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилалаиина, триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются в элюате позже неорганических солей.

Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простота проведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными преимуществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем, что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать

3-5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хроматографии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильтрацию используют особенно часто.

Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматография -- удобный способ фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низкомолекулярных примесей, в том числе солей.

В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделения белков по размерам начали применять макропористые неорганические носители -- макропористые стекло и силикагель. Обычно поверхность этих материалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исключить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разделять белки по размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесс и снижает помехи со стороны диффузии.

Реферат на тему:

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от массы белка, и от его суммарного электрического заряда, и от конфигурации, и от жесткости упаковки белковой глобулы. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием DDC-Na позволяет разделять белки, различающиеся между собой только по молекулярной массе. Для этого смесь белков в исходном препарате обрабатывают не менее, чем трехкратным избытком DDC-Na (по весу). За счет гидрофобных взаимодействий детергент одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг DDC-Na на 1 мг белка.

Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимый детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Благодаря электростатическому отталкиванию тесно расположенных отрицательно заряженных остатков серной кислоты, белковая цепь распрямляется и приобретает форму жесткой палочки с поперечником -1,6 m и длиной, зависящей только от числа звеньев этой цепи, а следовательно - от молекулярной массы белка.

Одновременно с обработкой DDC-Na необходимо обеспечить возможность полного развертывания белковой цепи, а для этого - разорвать все ковалентные S-S связи внутри молекулы белка. С этой целью белок перед электрофорезом обрабатывают еще и высокой концентрацией (1%) (3-меркаптоэтанола при повышенной температуре.

Электрофретическая подвижность, т. е. скорость миграции при напряженности поля 1 В/см, жесткого комплекса белок DDC-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением A-BIgM, где А и В - коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и" удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и «лидирующего красителя» - бромфенолового синего. Обозначим это отношение Rf. Такая замена отразится только на значении коэффициентов А и В, о которых нам известно только то, что они в данных условиях опыта одинаковы для всех белков. Измененные величины коэффициентов тоже будут постоянными величинами в данном опыте. Поэтому вместо их определения пользуются методом сравнения с известными по своей массе «маркерами». Одновременно с электрофорезом изучаемой смеси белков, отдельным треком на той же пластинке, т.е. в тождественных условиях эксперимента, разделяют смесь известных маркеров. С их помощью по точкам строят зависимость lgM=f(Rf), которая, естественно, оказывается прямолинейной. Опираясь на эту зависимость, можно графически, по измеренным величинам Rf определить значения lg М, а следовательно и М для исследуемого белкА. Разумеется, вся предварительная обработка детергентом и Р-меркаптоэтанолом должна быть проведена строго одинаково для этого белка и всех маркеров.

Выбор буфера в этом варианте не играет роли, так как заряд белка определяется его комплексом с DDC-Na. Обычно используют нейтральный буфер, добавляя в него 0,1% DDC-Na, чтобы поддержать комплекс детергента с белками»

Для белков с молекулярной массой менее 12 тысяч дальтон определение М становится ненадежным. Для различных диапазонов масс белков рекомендуется использовать ПААГ различной пористости, согласно следующей таблице:

Диапазон М (тысяч дальтон) % ПААГ 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Сам процесс электрофореза и окраски белков после его окончания производят как обычно, но DDC-Na от белка предпочтительно отмыть до окраски, вымачивая гель в 50% -ной ТХУ в течение ночи.

DDC-Na в комплексе с белком в некоторой мере препятствует окрашиванию (большой отрицательный заряд!).

Двумерный электрофорез в ПААГ

Полное разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить в ходе одного электрофоретического эксперимента. Всегда есть вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения их электрофоретических подвижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях фракционирования смеси белков имеет смысл использовать разделение в первом направлении как исходное для разделения во втором, перпендикулярном первому направлении при измененных условиях электрофореза.

Для этого трек первого направления (без осаждения и окраски белков в нем) вырезают и накладывают на стартовую зону пластинки второго направления (без карманов). Контакт между двумя гелями обеспечивают заливая место их соприкосновения расплавленным раствором агарозы в том же буфере. Электрофорез, естественно, ведут в направлении, перпендикулярном полоске. Каждая негомогенная полоса в ней может дать несколько пятен во втором направлении, если в новых условиях содержавшиеся в ней белки обретут различную электрофоретическую подвижность. В результате после осаждения и прокрашивания на пластинке появляется картина распределенных по всей поверхности пятен («фингерпринт»). Число пятен различных белков, которое удается зафиксировать на одной пластине может достигнуть нескольких сотен. На рис. 42 воспроизведена картина распределения пятен, полученных при двумерном электрофорезе белков из большой субъединицы одной из бактерий (в работе Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).

Извлечение белков из геля после электрофореза

Для целей аналитической идентификации белки из ПААГ (без осаждения и окраски) можно перенести на нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Такие фильтры обладают способностью сорбировать основные белки. Перенос осуществляется путем вымывания белковых полос из геля током буфера в направлении, перпендикулярном поверхности пластинки. Фильтр накладывают непосредственно на влажный гель. Устройство для обеспечения тока буфера от геля к фильтру будет описано ниже в связи с электрофорезом ДНК.

В результате на фильтре получаются «реплики» белков, разделенных в геле. Для их идентификации можно использовать характерные реакции, иногда ферментативные или имунные (см. ниже), а также гибридизацию с мечеными радиоактивным фосфором ДНК или РНК, если эти белки in vivo связывались с ДНК или разделению подвергались рибосомальные белки, связывающиеся с РНК рибосом.

Главное, что с точки зрения электрофореза отличает нуклеиновые кислоты от белков - это значительный по величине суммарный отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты в связях между нуклеозидами. рН окружающей среды мало влияет на этот заряд. Поэтому электрофорез можно вести не в буфере, а в любом подходящем ионосодержащем растворе, например в слабом растворе щелочи. Во всех случаях в жидкую среду вносят ЭДТА до концентрации 1-2 mM. Это необходимо для блокирования действия нуклеаз и предупреждения осаждения (особенно РНК) двухвалентными металлами.

Таким образом, разделение фрагментов ДНК и РНК электрофорезом приходится вести только по размеру. Однако размеры эти могут варьировать в очень широких пределах: от десятков нукле-отидных звеньев до многих сотен тысяч, а если выражать через молекулярные массы, то от нескольких тысяч до сотен миллионов дальтон.

Естественно, что для фракционирования относительно коротких фрагментов используют электрофорез в ПААГ, а для разделения высокомолекулярных ДНК, более крупнопористый носитель - агарозу. С ней мы познакомимся чуть позже. А пока в порядке связи с предыдущими параграфами уместно сделать несколько замечаний об электрофорезе ДНК в ПААГ. В нижеследующей таблице представлены рекомендации по выбору пористости геля в зависимости от размеров относительно коротких фрагментов ДНК, охарактеризованных числом пар оснований (п.о.):

Диапазон п.о. (штук)

В последнем диапазоне этой таблицы находятся предельные размеры ДНК, доступные автоматическому секвенированию последовательности нуклеотидов. Этот революционный метод анализа ДНК будет рассмотрен в следующей главе.

Сейчас же, прежде, чем перейти к электрофорезу в агарозе, я хочу познакомить учащихся и читателей с новыми идеями фракционирования крупных фрагментов ДНК в ПААГ с оригинальным использованием импульсов электрического напряжения, подаваемых на гель. Эти импульсы подаются поочередно в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Идея здесь заключается вот в чем. Даже очень длинная и гибкая молекула ДНК может протиснуться через относительно малые поры геля, если она вытянута в направлении продвижения к «основному» аноду, скажем, расположенному внизу пластинки. Напряжение на этот анод подается не постоянно, а импульсами. Второй, «вспомогательный» анод создает напряженность электрического поля, перпендикулярную основному направлению движения ДНК к низу пластинки. Напряжение на него подается тоже достаточно мощными, но более короткими импульсами, чем на основной анод, чередуясь с ними.

Назначение «перпендикулярного» электрического поля состоит в том, чтобы поворачивать длинные молекулы больших ДНК так, чтобы в момент подачи «продольного» импульса они находились в положении, благоприятном для движения вдоль пластинки вниз, к основному аноду. Чем длиннее цепи ДНК, тем медленнее они будут менять свою ориентировку и потому медленнее подвигаться в нужном направлении. Авторы метода утверждают, что таким образом в ПААГ им удавалось разделять фрагменты ДНК длиной до пяти миллионов пар оснований.

Гели агарозы

Агароза - это особо чистая фракция природного, линейного полисахарида, агара, выделяемого из морских водорослей. Мы с ним уже встречались.

Молекулярная масса одиночных нитей агарозы лежит в пределах 10-100 тысяч дальтон. Агароза для электрофореза поставляется в виде лиофилизированного (высушенного в вакууме) порошка. Гелеобразование происходит при остывании даже очень разбавленного горячего раствора агарозы в буфере. При температуре 84-96° С (а у некоторых типов агарозы уже при 70°) нити полимера плавятся и образуют с окружающей водной средой однородную прозрачную жидкость. Она обладает ярко выраженным температурным гистерезисом - застывает при температуре порядка 40°С. Остывая до этой температуры, даже 0,4% -ные растворы агарозы образуют прочные гели. У легкоплавких типов агарозы температура затвердевания снижается до 30°. Такая особенность агарозы облегчает все манипуляции с ее растворами, не опасаясь их затвердевания. Более того, расплавленную на кипящей бане взвесь агарозы в воде охлаждают до 50-55° и только при этой температуре добавляют концентрат буфера и все другие добавки, а затем заливают в форму для электрофореза. Это удобно и не связано с возникновением тепловых деформаций.

Остывая, хаотически ориентированные нити затвердевшей агарозы благодаря множественным водородным связям между нитями собираются в жгуты. Эти жгуты свободно перекрещиваясь, создают в окружающей их жидкости очень крупнопористую и, вместе с тем, жесткую пространственную сетку.

Размер пор геля агарозы, естественно, связан с концентрацией ее исходного раствора. Можно привести некоторые рекомендации по выбору этой концентрации, почерпнутые из опыта электрофореза нуклеиновых кислот:

Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид 0,4-0,5%.

Для рестриктов ДНК, содержащих 5-20 тысяч пар оснований 0,7-0,8%.

Для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК рео-вируса 1,5%.

Для рибосомальных РНК - 1,75%.

Для иРНК и рестриктов ДНК до 1000 п.о. - 2% .

Приготовление пластины для электрофореза в агарозе очень просто. Нужного размера стекло оклеивают со всех сторон по ребру сплошной липкой лентой так, чтобы ее верхний край на несколько миллиметров выступал над поверхностью стекла. Последнее кладут на строго горизонтальный столик. Прямо на стекло выливают рассчитанный объем еще жидкого раствора агарозы. Затем в него близ одного края стекла устанавливают гребенку, подобную той, которую ставят в форму ПААГ перед его полимеризацией. Только на этот раз гребенку погружают в агарозу перпендикулярно стеклу (зубцы ее, однако, не должны касаться стекла). После застывания агарозы гребенку вынимают, образуя таким образом «колодцы» для препаратов. Электрофорез ведут в горизонтальном положении (в треках), накладывая фитили, идущие от резервуаров с буферами. Рабочее значение напряженности поля 2-5 В/см.

ДНК, особенно двунитевые, а также и РНК хорошо окрашиваются желтым флюоресцентным красителем - бромистым эти-дием. Этот краситель несет положительный заряд, что позволяет ему взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Кроме того он способен интеркалировать (встраиваться) между оснований двунитевой ДНК, что приводит к резкому усилению его флюоресценции при освещении ультрафиолетовым светом. Окраску можно производить и после электрофореза вымачиванием геля в течение 0,5-1 часа в водном растворе красителя (1 мкг/мл) или же вводить его непосредственно в гель. В последнем случае можно следить за движением полос в геле. Стеклянную пластину в этом случае освещают УФ-лампой снизу. Чувствительность окраски высока. Можно наблюдать и фотографировать полосы, содержащие 0,01 мкгДНК.

В конце электрофореза ДНК можно зафиксировать в геле осаждением из раствора, вымачивая гель в 70% -ном этаноле.

Пипетки

Конечно, современные микропипетки совсем не похожи на те, которые употребляют в школьном химическом кабинете. Их устройство таково. Довольно объемистую, пластмассовую (снаружи) рукоятку пипетки удобно держать четырьмя пальцами руки, оставив большой палец свободным для нажатия кнопки, торчащей из верхнего конца рукоятки. Книзу из нее выходит длинный, слегка конический металлический стержень, на конец которого плотно надевается конический полый наконечник из специальной пластмассы.

В рукоятке спрятан механизм, главную часть которого составляют очень точно подогнанные друг к другу тонкий цилиндр и поршень, отжимаемый кверху пружиной. Нажатием кнопки поршень перемещается вниз. Опустив наконечник в жидкость и освободив предварительно нажатую кнопку набирают в наконечник объем в 1, 2, 3 и более микролитров - в соответствии с калибровкой пипетки. Вторичным нажатием кнопки жидкость из наконечника полностью выталкивается. Наконечники поставляются стерилизованными и используются однократно.

Есть пипетки с возможностью предварительной регулировки объема жидкости, например, от 2-х до 20-ти микролитров. Регулировку осуществляют поворотом головки винта, который устанавливает длину хода поршня. Выбранный объем указывает связанный с винтом градуированный барабанчик.

Влияние вторичной структуры ДНК

В электрофоретическом поведении однонитевых (денатурированная ДНК, РНК) и двунитевых молекул нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей их нативная двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров однонитевая молекула. Она труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. В силу этого относительно короткие двунитевые фрагменты ДНК будут отставать при электрофорезе в ПААГ от денатурированных ДНК такой же длины. Такая ситуация будет иметь место даже для ДНК бактериофага ФХ-174 с молекулярной массой в 3,5 миллиона дальтон. Однако для более крупных молекул ситуация может измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка оказывается уже достаточно гибкой: она продвигается через поры геля как бы «извиваясь ужом». Между тем однонитевая цепь той же длины сворачивается в рыхлый «хаотический клубок» такого размера, что его продвижение в геле оказывается более затрудненным. Денатурированная ДНК в этом случае при электрофорезе отстает от нативной. Естественно, что граница обращения описанного эффекта зависит от размеров пор геля.

Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий имеют структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца - «сверхскрученное» (ему отвечает минимум внутренних напряжений). Кольцо в целом сворачивается в «жгут», что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух скрученных нитей кольца появляется единичный разрыв сахаро-фосфатной цепи, то жгут разворачивается и под действием сил электростатистического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы уменьшается, ее наружные размеры увеличиваются (форма II). Что касается линейной двухните-вой молекулы ДНК (форма III), то в зависимости от среднего размера пор геля она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней массы. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I; для более мелких пор на первый план выступает большая гибкость линейной молекулы ДНК (форма III).

Скорость миграции линейных двухнитевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их массы, но лишь до определенного предела. При молекулярной массе более 5 миллионов в 1,6%-ном геле агарозы и при массе более 12 миллионов дальтон в 0,8% -ной агарозе молекулы мигрируют практически с одинаковой скоростью, независимо от их массы. В этих случаях решающую роль играет гибкость - способность очень длинных молекул, извиваясь, проходить через гель одинаково легко (или одинаково трудно) при любой длине.

Рибосомальные РНК могут иметь существенно более невыгодную для миграции в геле вторичную структуру, чем ДНК. Дело в том, что у крупных молекул РНК эта структура представлена многочисленными, торчащими во все стороны «шпильками». Это - места локального спаривания в жесткие двунитевые структуры отдельных, зачастую далеко отстоящих друг от друга по основной последовательности, комплементарных участков РНК. Такая молекула уже не может продвигаться через поры геля Собирая основной «сэндвич» (гель, фильтр и облегающие их листки фильтровальной бумаги) следует проверять, что между ними не остаются пузырьки воздуха.

Перенос ДНК на нитроцеллюлозный фильтр занимает 2-3 часа. Следует заметить, что короткие фрагменты ДНК на нитроцел-люлозном фильтре задерживаются плохо. Если это существенно, то лучше использовать фильтры из так называемой, «диазобума-ги» или «ДБМ-бумаги». Фирма Ватман выпускает ее под наименованием «Whatman 540».

Литература

1 Курашвили Л.В. Нарушения, липидного обмена при состояниях напряжения. II Захарьинские чтения. Тезисы докладов. - 1995. -С.127.

2 Курашвили Л.В. Активность липазы и ЛХАТ при длительном обезвоживании. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. - Пенза, 1995. -С.71-72.

3 Курашвили Л.В. Фосфолипидный статус при нарушении водно-электролитного обмена. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. - Пенза, 1995.-С.69-70.